Padalecki bắt đầu diễn xuất với một vai diễn nhỏ trong phim "A Little Inside" năm 1999; năm 2000, anh vào vai Dean Forester rất thành công trong "Gilmore Girls". Trong suốt những năm qua, anh đã tham gia một vài bộ phim truyền hình như "Silent Witness", "Close to Home" và ‘Ring of Endless Light".

Padalecki được mời tham gia vai Sam Winchester trong bộ phim truyền hình của hãng WB (sau này chuyển sang CW) Supernatural. Sam và người anh em của mình là Dean (Jensen Ackles) rong ruổi khắp Hoa Kỳ để săn lùng những quái vật siêu nhiên, đôi lúc cùng đi với cha mình John (Jeffrey Dean Morgan) cho đến khi ông bị giết. Phần 6 của phim đã được khởi quay vào năm 2010, phim được quay tại Vancouver, British Columbia, Canada.

Padalecki dẫn chương trình trong phần dòng rùng rợn thực tế của hãng MTV mang tên ‘’Room 401" vốn đã bị dừng lại sau 8 tập không thành công.[6]